Phân lập và định danh tác nhân gây bệnh đốm lá cây cải ngọt

ii
TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu: “Phân lập và định danh tác nhân gây bệnh đốm lá cây cải ngọt
tại Tp HCM bằng phƣơng pháp PCR và giải trình vùng 16S – 23S rDNA” đƣợc thực
hiện từ ngày 6 tháng 2 năm 2005 đến ngày 30 tháng 7 năm 2006 tại trƣờng Đại Học
Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền
Nam.
Đề tài do sinh viên Trần Văn Kỳ thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Lê Đình
Đôn và KS. Hoàng Xuân Quang.
Đối tƣợng nghiên cứu là vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris gây
bệnh đốm lá trên cây cải ngọt. Hiện nay, tại các vùng trồng rau ở Huyện Củ Chi, Hóc
Môn và quận 12, thành phố Hồ Chí Minh, bệnh đốm lá đang gây thiệt hại rất lớn cho
nông dân trồng rau cải ngọt. Triệu chứng điển hình của bệnh là sự xuất hiện các đốm
nhỏ có kích thƣớc 1 – 2 mm trên lá rau. Khi bệnh phát triển, các đốm bệnh lớn dần, có
thể lên kết lại dẫn đến lá rau bị vàng và chết. Bệnh làm giảm năng suất cũng nhƣ chất
lƣợng cây rau cải ngọt.
Mục đích đề tài nhằm định danh tác nhân gây bệnh bằng kỹ thuật PCR, giải trình
tự gen nhằm làm cơ sở cho các nghiên cứu phòng và trị bệnh sau này.
Các nội dung nghiên cứu bao gồm:
1. Phân lập tác nhân gây bệnh từ các mẫu bệnh thu đƣợc từ các vùng trồng rau ở
huyện Củ Chi, Hóc Môn và quận 12, thành phố Hồ Chí Minh.
2. Dùng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen nhằm định danh tác nhân gây bệnh.
Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
1. Phân lập đƣợc 8 dòng vi khuẩn gây bệnh đốm lá tại các vùng trồng rau thuộc
huyện Củ Chi, Hóc Môn và quận 12, Tp HCM.
2. Sử dụng kỹ thuật PCR đã khuyếch đại vùng 16S – 23S rDNA ITS làm vật liệu
giải trình tự và gen hrpF đặc trƣng của vi khuẩn gây bệnh.
3. Do hạn chế phƣơng pháp giải trình tự gen không mang lại kết quả. Tuy nhiên,
kết quả PCR cho phép xác định vi khuẩn gây bệnh thuộc giống Xanthomonas
campestris pv. campestris.


iii
MỤC LỤC

CHƢƠNG TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ i
Tóm tắt ii
Mục lục iii
Danh sách các chữ viết tắt vi
Danh sách các bảng vii
Danh sách các hình viii

1. MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích và yêu cầu 2
1.2.1. Mục đích 2
1.2.2. Yêu cầu 3
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
2.1. Tổng quan nghiên cứu ngoài nƣớc 4
2.1.1. Lịch sử phát hiện và sự phân bố. 4
2.1.2. Tác nhân và triệu chứng bệnh 5
2.1.3. Tác động kinh tế của bệnh. 6
2.1.4. Sinh lý, sinh thái và điều kiện phát triển bệnh. 7
2.1.5. Hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn gây bệnh. 8
2.1.6. Phƣơng pháp phân lập và dịnh danh tác nhân gây bệnh 8
2.1.7. Những nghiên cứu về phát hiện và dịnh danh tác nhân gây
bệnh bằng phƣơng pháp sinh học phân tử………………… 10
2.2. Tổng quan nghiên cứu trong nƣớc 12
2.3. Vùng ITS (rDNA intergenic spacer) và gen hrpF
(hypersensitive reaction and pathogenicity). 13
2.3.1. Gen hrpF (hypersensitive reaction and pathogenicity). 13


iv
2.3.2. Ribosome DNA (rDNA). 13
3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 15
3.1. Thời gian và địa điểm 15
3.1.1. Thời gian 15
3.1.2. Địa điểm 15
3.2. Vật liệu 15
3.3. Hóa chất 15
3.3.1. Các hóa chất dùng ly trích DNA từ vi khuẩn 15
3.3.2. Các hóa chất dùng trong điện di 16
3.3.3. Hóa chất cho phản ứng PCR (do công ty Bio – Rad cung cấp) 16
3.3.4. Môi trƣờng 17
3.4. Dụng cụ, thiết bị 17
3.5. Phƣơng pháp 17
3.5.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu bệnh 17
3.5.2. Phƣơng pháp phân lập vi sinh vật từ mẫu bệnh 18
3.5.3. Phƣơng pháp chủng bệnh trên rau cải trồng trong nhà lƣới 18
3.5.3.1. Phƣơng pháp trồng cây kí chủ 18
3.5.3.2. Chủng bệnh 19
3.5.4. Phƣơng pháp ly trích DNA từ vi khuẩn 20
3.5.5. Phƣơng pháp PCR 20
3.5.5.1. Khuếch đại đoạn DNA trong vùng ITS của vi khuẩn 20
3.5.5.2. Khuếch đại đọan DNA trong gen hrpF 22
3.5.6. Phƣơng pháp điện di và đọc kết qủa 22
3.5.6.1. Điện di trên gel agarose 22
3.5.6.2. Đọc kết quả điện di 22
3.5.7. Phƣơng pháp xác định trình tự gen từ sản phẩm PCR. 23
3.5.7.1. Chuẩn bị khuôn DNA. 23
3.5.7.2. Phản ứng đọc trình tự sử dụng BigDye Terminator V3.1
Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems). 24
3.5.7.3. Tinh sạch sản phẩm khuếch đại. 25
3.5.7.4. Chạy điện di và ghi nhận tín hiệu trên máy sequencer. 25


v
3.5.7.5. Quy trình tóm tắt các bƣớc đọc trình tự. 26
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27
4.1. Kết quả thu thập và phân lập mẫu vi khuẩn gây bệnh. 27
4.2. Kết quả chủng bệnh trên rau cải ngọt trồng trong nhà lƣới 28
4.3. Kết quả ly trích và pha loãng DNA vi khuẩn. 31
4.4. Kết quả phản ứng PCR. 32
4.4.1. Kết quả PCR khuếch đại vùng ITS. 32
4.4.2. Kết quả điện di tinh sạch sản phẩm PCR 32
4.4.3. Kết quả PCR khuếch đại vùng hrpF. 33
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO 36
PHỤ LỤC 39





















vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CTAB :Cethyltrimethylammonium bromide
EDTA :Ethyleneediamine tetraacetic acid
ng : nano gram
cDNA : complementary DNA
nm : nano mol
g : micro gram
m : micro mol
M : micro mol/lít
l : micro lít
TE : tris EDTA
dNTP : deoxyribonucleotide – 5 – trphosphate
TAE : tris acetic EDTA
UI : unit international
bp : base pair
Kb : kilo base
SDS : Sodium dodecyl sulphate
PDA : Potato Dextrose agar
RFLP : Restriction Fragment Lengh Polymorphism
RAPD : Random Amplification of Polymorphic DNA
Tm : melting temperature
ctv : cộng tác viên
PCR : Polymerase Chains Reaction
UV : Ultra violet
CC : Củ Chi
HM : Hóc Môn
Q12 : Quận 12
DC : Đối chứng



vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG

Bảng 1.1 Sự phát triển của một số loài vi khuẩn Xanthomonas trên
môi trƣờng bán chọn lọc 9
Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR……………………………………… 20
Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi Xan1330 và Xan 322…21
Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi XCR và XCF……… 21
Bảng 3.4 Lƣợng DNA tối ƣu cho phản ứng đọc trình tự………………………. 23
Bảng 3.5 Thành phần hóa chất cho mỗi phản ứng đọc trình tự…………… 24
Bảng 4.1 Danh mục các dòng vi khuẩn sử dụng trong đề tài……………… 26



















viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG

Hình 2.1 Sản phẩm rep – PCR trong nghiên cứu của
Youfu Zhao và ctv………………………………… 10
Hình 2.2 Cấu trúc vùng 16S – 23S rDNA ITS của vi khuẩn
Xanthomonas.………………………………………… ………… 11
Hình 3.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình đọc trình tự sản phẩm PCR……………… 25
Hình 4.1 Lá cải bị bệnh thu thập ngoài ruộng rau…………………………… 26
Hình 4.2 Vết bệnh trên lá cải thu thập ngoài ruộng chụp dƣới kính
hiển vi soi nổi….…….…………………………………………… 27
Hình 4.3 Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng thạch………………………… 27
Hình 4.4Vết bệnh sau khi chủng và vết thƣơng không bị nhiễm chụp
dƣới kính hiển vi soi nổi……………………………………………28
Hình 4.5 Lá cải sau khi chủng bệnh 4 ngày, bên phải gân lá không bị nhiễm và
bên trái bị nhiễm……………………………………………………29
Hình 4.6 Kết quả ly trích DNA từ các dòng vi khuẩn………………… … 30
Hình 4.7 Kết quả hiệu chỉnh nồng độ DNA………………………………… 30
Hình 4.8 Kết quả khuếch đại vùng 16S – 23S rDNA……………………… 31
Hình 4.9 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR………………………………… 32
Hình 4.10 Kết quả khuếch đại đoạn DNA vùng hrpF…………….…………. 32




Chƣơng 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cây rau cải nằm trong họ thập tự đƣợc trồng phổ biến ở khắp châu Âu,
Địa Trung Hải, nơi đƣợc coi là nguồn gốc của chúng (Nguyễn Văn Thắng, Trần Khắc
Thi, 1996). Chúng đƣợc sử dụng rộng rãi làm thức ăn cho ngƣời và gia súc,
làm nguyên liệu nghành dƣợc. Cây cải chiếm vị trí quan trọng bậc nhất trong
ngành rau nhờ chủng loại phong phú, sản lƣợng cao, thích nghi rộng rãi với điều kiện
thời tiết, đất đai khác nhau, dễ vận chuyển, cất giữ lâu, dễ ăn, dễ chế biến và nấu
nƣớng.
Rau là loại thực phẩm không thể thiếu trong bữa ăn hằng ngày của con ngƣời,
đặc biệt là với các dân tộc Châu Á và nhất là với ngƣời Việt Nam. Dù ở đâu – trong
nƣớc hay ngoài nƣớc – bữa ăn của ngƣời Việt Nam luôn có món rau với số lƣợng
nhiều hơn so với của các dân tộc khác. Có lẽ vì vậy mà ngƣời Việt trẻ hơn, đẹp hơn so
với ngƣời cùng lứa tuổi của các châu lục khác.
Theo sự phát triển của đời sống xã hội, nhiều nhà dinh dƣỡng học của Việt Nam
cũng nhƣ của thế giới nghiên cứu về khẩu phần thức ăn cho nguời Việt Nam đã
tính rằng hàng ngày chúng ta cần khoảng 2300 – 2500 calo năng lƣợng để sống và
hoạt động. Để có đƣợc năng lƣợng này, nhu cầu tiêu dùng rau hằng ngày trung
bình cho một ngƣời phải vào khoảng 250 – 300 g (tức là khoảng 7,5 – 9 kg/ngƣời
mỗi tháng). Còn nghiên cứu của nhà khoa học Pháp, ông Dorolle từ năm 1942 đã
tính là khoảng 360 g/ngày (tức là khoảng 10,8 kg/một tháng cho mổi ngƣời). Theo
các số liệu thống kê thì hiện nay tính bình quân chung cả nƣớc chúng ta mới sản
xuất đƣợc khoảng 4 – 5 kg/ngƣời mỗi tháng (không tính phần sản xuất tự túc trong
dân) (Nguyễn Văn Thắng và Trần Khắc Thi, 1996).
Nhƣng tác dụng của rau không phải là bảo đảm số calo chủ yếu trong khẩu phần
dinh dƣỡng mà là cung cấp đủ chất xơ (xenlulo) để kích thích hoạt động của nhu mô
ruột và các sinh tố (vitamin) cho cơ thể.
Ở phía nam nƣớc ta, cải ngọt đƣợc trồng nhiều ở các tỉnh nhƣ: Tp HCM, Đồng Nai,
Lâm Đồng, Long An. Cùng các loại rau khác, cải ngọt đã mang lại nhiều lợi ích thiết
thực cho đời sống con ngƣời nhƣ cung cấp rau tƣơi, bổ sung nguồn dinh dƣỡng, chất
xơ cũng nhƣ các loại vitamin. Trong một vài năm trở lại đây, do tốc độ đô thị hóa diễn


2
ra nhanh, các khu công nghiệp tập trung số lƣợng lớn công nhân, do vậy nhu cầu
lƣợng rau xanh hàng ngày rất lớn. Chính vì vậy, cây cải ngọt (Brassica chinensis L.)
đƣợc nông dân quan tâm, chọn trồng nhiều do chúng có những đặc tính sinh
trƣởng phù hợp cho việc thu hoạch thƣờng xuyên nhƣ: thời gian sinh trƣởng ngắn
(30 – 35 ngày), trồng đƣợc quanh năm, có nhiều giống trồng trong cả mùa khô và mùa
mƣa, năng suất cao, đáp ứng đƣợc nhu cầu của thị trƣờng.
Đối với cây cải ngọt, do hàm lƣợng nƣớc lớn, trên 90% (Mai Thị Vinh và Phạm Văn
Biên, 1985) nên là ký chủ thích hợp cho nhiều loại vi sinh vật gây bệnh nhƣ nấm, vi
khuẩn. Nhóm vi khuẩn gây bệnh trên cây cải ngọt bao gồm: vi khuẩn gây thối nhũn,
cháy lá chữ V, đốm lá. Bệnh đốm lá vi khuẩn không phải là đối tƣợng quan trọng.
Nhƣng hiện nay, khi diện tích gieo trồng tăng, trồng nhiều vụ trong năm, có sự tích lũy
nguồn bệnh qua các vụ, nó trở thành vấn đề đƣợc nhiều ngƣời quan tâm.
Triệu chứng ban đầu của bệnh là các đốm nhỏ xuất hiện ở bề mặt dƣới của lá. Vết
bệnh dạng tròn, sũng nƣớc, đƣờng kính từ 1 – 3 mm. Vết bệnh lúc già thì phần mô ở
giữa bị hoại tử, nhìn mặt trên lá sẽ thấy các đốm màu nâu. Bệnh cũng xuất hiện ở phần
thân và cuống lá làm cho lá bị cong lại và vết bệnh có màu đen.
Bệnh làm giảm năng suất, giá trị thƣơng phẩm của rau, giảm thời gian bảo quản nên
giá trị kinh tế không cao. Hơn nữa, ngoài cải ngọt, bệnh cũng gây hại trên khá nhiều
các loại cây trồng khác cùng họ thập tự nhƣ: cải bắp, súp lơ, cải thảo, cải xanh. Chính
vì vậy, xác định đƣợc tác nhân gây bệnh là việc cần thiết nhằm làm cơ sở cho các
nghiên cứu phòng trừ sau này.
Đó là lý do tôi chọn thực hiện đề tài: “Phân lập và định danh tác nhân gây bệnh
đốm lá cây cải ngọt tại Tp. HCM bằng phƣơng pháp PCR và giải trình tự vùng
16S – 23S rDNA”. Đề tài là một phần trong chƣơng trình nghiên cứu bệnh vi khuẩn
trên cây họ thập tự của Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Đại Học Nông Lâm
Tp. HCM.
1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài
1.2.1. Mục đích
Định danh tác nhân gây bệnh đốm lá trên cây cải ngọt làm cơ sở cho các nghiên
cứu sâu hơn sau này nhằm phòng trừ bệnh có hiệu quả, giảm thiểu thiệt hại cho
nông dân trồng rau.


3
1.2.2. Yêu cầu
- Thu thập mẫu bệnh phẩm tại các vùng trồng rau Củ Chi, quận 12, Hóc Môn.
- Phân lập vi sinh vật từ mẫu bệnh phẩm.
- Chủng bệnh trên cây rau cải trồng trong nhà lƣới.
- Chọn lọc các dòng vi khuẩn gây bệnh trong số các dòng thu thập đƣợc dựa
vào kết quả chủng bệnh.
- Ly trích DNA và thực hiện phản ứng PCR định danh tác nhân gây bệnh.
- Đọc trình tự vùng 16S – 23S rDNA.
















Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan nghiên cứu ngoài nƣớc
2.1.1. Lịch sử phát hiện và sự phân bố

Xem chi tiết: Phân lập và định danh tác nhân gây bệnh đốm lá cây cải ngọt