Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368
3-60 nucleotide). Đoạn này gắn kết với and khuôn tại điểm khởi đầu sao chép.
Đó là đặc điểm quan trọng đầu tiên của PCR vì ADN polymerase đợc điều khiển
để tổng hợp một đoạn ADN đặc thù. Quá trình này đợc enzyme adn polymerase
điều khiển để tổng hợp nên một sợi ADNđặc thù. Các sợi ADN mạch đơn làm
khuôn đợc tạo ra theo cách đơn giản là nâng nhiệt độ lên trên 90 độ C mà thờng là
94 độ C cho chuỗi xoắn kép ADN bung ra.
Cả hai sợi ADN đều đợc dùng làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu các
đoạn mồi (primer) đợc cung cấp để bám vào vị trí tơng ứng cho cả hai sợi. Trong
kỹ thuật PCR, các đoạn mồi đợc chọn nằm ở hai đầu đoạn ADN cần nhân lên sao
cho các sợi ADN tổng hợp mới đợc bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía
đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm có độ dài nằm giữa hai đoạn mồi này.
Độ dài của sản phẩm PCR có thể từ vài trăm đến hàng ngàn, thậm chí hàng chục
ngàn cặp nucleotide. Nh vậy, sau mỗi chu kỳ, các điểm bám cho các đoạn mồi lại
xuất hiện cho mỗi ADN mới đợc tổng hợp . Hỗn hợp phản ứng lại đợc nâng nhiệt
độ lên thích hợp sao cho các sợi ban đầu tách khỏi sợi mới tổng hợp, các sợi này
sau đó đợc dùng làm khuôn cho chu kỳ tiếp theo, bao gồm các bớc: gắn mồi, tổng
hợp ADN và tách rời các đoạn.
Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ của phản ứng, tính
theo lý thuyết ta sẽ có 2
n
bản sao các phân tử ADN mạch kép nằm giữa hai đoạn
mồi. Đó là đặc điểm quan trọng thứ hai của kỹ thuật PCR. Nh vậy kết quả là một
đoạn ADN định trớc đợc nhân lên với một lợng rất lớn, ví dụ sau 32 chu kỳ số lợng
bản sao ADN của PCR sẽ là 1.073.741.824.
5
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368
IV. Cách tiến hành phản ứng PCR
PCR là một kỹ thuật phòng thí nghiệm tơng đối dễ làm, mặc dù đó là một kỹ
thuật rất đa năng và ứng dụng hết sức rộng rãi. Vật liệu khởi đầu cho PCR là ADN
có chứa đoạn cần nhân lên, gọi là khuôn ADN. Không phải lúc nào cũng cần thiết
tách chiết đoạn cần nhân lên vì việc đó đã đợc các đoạn mồi dùng trong phản ứng
xác định. Tuy nhiên nếu ADN làm khuôn tinh khiết thì phản ứng PCR sẽ rất nhạy
và đặc hiệu. Hàm lợng ADN khuôn cần cho phản ứng PCR rất nhỏ. Trong các thí
nghiệm bình thờng ở phòng thí nghiệm chỉ cần 1-100 nanogam (ng) tổng số của hệ
gen là đủ. Tuy nhiên ngày nay trong nhiều trờng hợp, phản ứng PCR có thể nhân
các đoạn ADN chỉ từ một phân tử ADN riêng lẻ.
Nguyên liệu cần thiết để tiến hành phản ứng invitro cũng giống nh nguyên
liệu cần thiết để tổng hợp ADN trong tế bào. Có 4 thành phần cần thiết là:
1. ADN làm khuôn (mạch kép) cần khuếch đại
2. Hai đoạn mồi để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp ADN.
3. Enzyme chịu nhiệt ADN-polymerase (hiện nay đợc dùng phổ biến
nhất là Tap, đợc chiết xuất từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus
aquaticus)
4. Tất cả 4 loại deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs): dATP,
dTTP, dCTP, dDTP.
Ngoài ra môi trờng đệm cung cấp ion Mg
++
và nớc tinh khiết rất cần thiết để
tiến hành kỹ thuật PCR.
Dung tích cho một phản ứng PCR thông thờng là 50 à hoặc 20 à .
Chu trình thực hiện
Để thực hiện phản ứng, chúng ta không chỉ đơn giản là cho tất cả nguyên liệu
vào ống nghiệm rồi đun nóng. Đây là một chu trình khép kín, gồm ba bớc cơ bản:
(3 bớc điều chỉnh nhiệt độ ) cho một chu kỳ:
1. Bung liên kết của ADN (denuteration):
Mục đích của việc này là làm biến tính ADN, khiến hai sợi ADN tách nhau ra.
Do đó, các đoạn mồi có thể gắn vào phần bổ sung trên ADN ở bớc sau. Cũng trong
bớc này, các phản ứng enzym đều ngừng lại (ví dụ nh sự mở rộng của chu trình tr-
ớc).
6
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368
Đợc thực hiện ở nhiệt độ khoảng 94
0
trong vài giây đến vài phút. Tại nhiệt độ
này, các phân tử ADN mạch kép sẽ bị tách ra hoàn toàn tạo nên các sợi đơn dùng
để làm khuôn cho các đoạn mồi bám vào và enzyme polymerase xúc tác tổng hợp.
2. Mồi bám ( hay còn gọi là ủ với mồi) (annealing):
Ngay lập tức nhiệt độ đợc hạ xuống 54
0
C để các đoạn mồi gắn với các trình tự
bổ xung tơng ứng trên các phân tử ADN làm khuôn.
Các đoạn mồi dịch chuyển lộn xộn dới chuyển động Brao (Brown). Liên kết
ion giữa các đoạn mồi đơn và các sợi khuôn đơn liên tục đợc tạo ra rồi lại đứt gãy.
Các liên kết bền vững hơn (do những mồi gắn đúng vào vị trí) kéo dài lâu hơn.
Trên những đoạn ngắn ADN mạch kép bao gồm khuôn và mồi này, ADN
polymerase có thể gắn vào và bắt đầu kéo dài chuỗi. Sau khi đã có một vài bazơ đ-
ợc gắn vào, liên kết hyđro giữa mạch khuôn và mồi trở nên đủ mạnh để nó không
bị đứt vỡ nữa.
Nhiệt độ gắn kết này góp phần quyết định tính đặc hiệu của phản ứng PCR.
Nhiệt độ và khoảng thời gian dùng ở đay thay đổi tuỳ thuộc vào chiều dài của
ADN cần nhân lên.
3. Tổng hợp (hay còn gọi là kéo dài)(extension):
Các đoạn mồi nào đã đợc kéo dài một vài bazơ thì có lực liên kết với khuôn
mạnh hơn lực phá vỡ chúng. Còn các mồi gắn không chính xác trở nên lỏng lẻo
(do nhiệt độ đã cao hơn) và không có sự kéo dài mạch xảy ra.
Nhiệt độ ngay lập tức đợc nâng lên 72
0
C, sự tổng hợp ADN diễn ra tối u dới
nhiệt độ này.
Nhiệt độ 72
0
C đợc duy trì trong 5 phút để các sợi ADN vừa đợc tổng hợp
xoắn vào nhau tạo nên ADN sợi kép.
Vào cuối giai đoạn này, nhiệt độ một lần nữa đợc nâng lên 94
0
C , nhng lần
này chỉ trong vòng 20 giây để cho các mẫu ngắn của ADN mạch kép (cả sợi ban
đầu và sợi mới đợc tổng hợp) tách nhau ra. Nh vậy một chu kỳ gồm: đun nóng để
tách các sợi ADN kép thành sợi đơn để làm khuôn, gắn kết các đoạn mồi vào sợi
khuôn và tổng hợp ADN bằng ADN polymerase, đợc lặp đi lặp lại khoảng từ 30
đến 60 lần.
7
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368
Sau chu kỳ cuối, nhiệt độ đợc duy trì ở 72
0
C trong 5-10 phút cho tất cả các
sợi đơn ADN có trong phản ứng xoắn lại tạo nên sản phẩm PCR. Cuối cùng nhiệt
độ đợc hạ xuống 4
0
C để bảo quản sản phẩm.
Hình ảnh minh hoạ các bớc của phản ứng PCR nh sau:
Sản phẩm của phản ứng PCR là đoạn ADN mà ta cần nhân lên. Sản phẩm đợc
kiểm tra bằng cách chạy điện di trên thạch Agarose nồng độ 0,8%-2%, và ADN
8
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368
của PCR sẽ đợc nhìn thấy rõ hơn dới tác dụng của tia cực tím (ultra-violet) sau khi
đực nhuộm bằng Ethidium Bromide, một loại hoá chất có khả năng bám và làm
hiển thị ADN. Độ dài của ADN sản phẩm đợc tính bằng cách so sánh với chỉ thị
ADN (ADN marker), sử dụng thông dụng nhất là ADN của thực khuẩn thể Lamda
cắt bằng enzyme giới hạn Hindlll.
V- Phản ứng RT-PCR (PCR ngợc)
* Nguyên lý:
Phản ứng RT-PCR thực chất là phản ứng nhân một đoạn giới hạn của
khuôn ARN theo nguyên lý của phản ứng PCR, bao gồm hai giai đoạn: Giai đoạn
thứ nhất là chuyển đổi một sợi ARN làm khuôn thành ADN hai sợi, sau đó qua
giai đoạn thứ hai, dùng ADN hai sợi này tiếp tục làm khuôn để thực hiện phản ứng
PCR nh đã giới thiệu.
ARN là một sợi bao gồm 4 nucleotide liên kết vơi nhau, trong đó có Adenin,
Guanin, Cystosin và Uracin. Chuỗi nucleotide này phải đợc chuyển đổi thành AND
2 sợi mà thành phần Uracin đợc thay thế bằng Thymin. Phản ứng làm biến đổi
ARN hệ gen thành AND phải nhờ đến vai trò của một loại enzyme gọi là enzyme
sao chép ngợc (Reverse Transcriptase), do vậy giai đoạn này đợc gọi là chuyển ng-
ợc (RT), đợc thực hiện ở nhiệt độ 50-55 độ C trong 30 phút. Khi đã có ADN 2 sợi
làm khuôn chuyển đổi từ ARN ban đầu, phản ứng tiếp theo là PCR nh đã giới thiệu
và đợc thực hiện theo 3 bớc thay đổi nhiệt độ cho phù hợp ở mỗi chu kỳ. Toàn bộ
phản ứng nhân một đoạn ADN từ khuôn ARN qua hai giai đoạn nói trên đợc gọi là
phản ứng RT-PCR hay phản ứng PCR ngợc.
Do một số virus có hệ gen là ARN cho nên muốn nhân một đoạn gen của nó
thì ngời ta phải dùng phản ứng RT-PVR. Một số nghiên cứu về ARN thông tin
cũng cần đến phản ứng RT-PCR để chuyển đổi sợi ARN thành ADN cho quá trình
đồng hoá để giải trình tự hoặc tái tổ hợp trong nghiên cứu biểu thị protein.
Trớc khi tiến hành phản ứng PCR phải thực hiện giai đoạn chuyển ngợc RT,
sau đó thành phần ADN đợc chuyển đổi này làm khuôn tiếp tục mới đợc nhân lên
bằng phản ứng PCR. Quá trình này gồm hai giai đoạn:
- Phản ứng RT: Đó là giai đoạn chuyển ARN hệ gen thành ADN nhờ
enzyme sao chép ngợc biến ARN ở dạng sợi đơn sang dạng sợi kép ADN bằng
cách thực hiện phản ứng ở nhiệt độ 55 độ C trong vòng 30 phút.
9
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368
- Phản ứng PCR: là giai đoạn gồm 3 bớc nh đã nới ở trên.
* Cách tiến hành:
- Giai đoạn 1 (RT): 1 chu kỳ. Thực hiện sao chép ngợc từ ARN sợi đơn sang
AND sợi kép ở nhiệt độ 55 độ C trong vòng 30 phút.
- Giai đoạn 2 (PCR):
+ Bớc khởi đầu: 1 chu kỳ. Bung liên kết: Bung chuỗi xoắn kép ADN 2 sợi
thành khuôn 1 sợi làm khuôn và cho primer bám vào: 94-95 độ C/ 1 phút.
+ Bớc 1: Bung liên kết: Bung chuỗi xoắn kép ADN 2 sợi thành khuôn 1 sợi
làm khuôn và cho primer bám vào: 94-95 độ C/ 1 phút
+ Bớc 2: Bám mồi
+ Bớc 3: Tổng hợp ADN kéo dài
(Các bớc 1,2,3 đợc thực hiện lặp đi lặp lại trong 35-40 chu kỳ).
+ Bớc kết thúc: (1 chu kỳ), hoàn chỉnh gen ADN cho sản phẩm; 72 độ trong
1 phút.
Cuối cùng nhiệt độ đợc hạ xuống 4
0
C để bảo quản sản phẩm.
VI- Kiểm tra kết quả PCR:
Trớc khi sản phẩm PCR đợc đem sử dụng, ngời ta cần phải kiểm tra:
1. Sản phẩm có đợc hình thành hay không:
Cho dù hoá sinh có là ngành khoa học chính xác đến đâu đi nữa, ngời ta cũng
không thể chắc chắn rằng mọi phản ứng PCR đều thành công. Chất lợng của ADN
có thể quá tồi, do đó một trong các đoạn mồi có thể không phù hợp, hoặc cũng có
thể có quá nhiều điểm bắt đầu.
2. Kích thớc của sản phẩm có đúng không:
Có khả năng sản phẩm chỉ dài 500 bazơ, mà trên thực tế gen cần khuếch đại
lại dài 1800 bazơ. Khi đó, một trong hai mồi có thể đã gắn (phù hợp) với phần nào
đó trên gen mà gần với mồi còn lại hơn. Cũng có thể cả hai mồi đã gắn vào một
gen hoàn toàn khác.
Kết quả của PCR đợc kiểm tra thông qua băng điện di. Ngời ta thờng sử dụng
phơng pháp điện di trên gel agarose. Nếu không có sản phẩm nào đợc tạo ra, trên
băng điện di sẽ không có vạch nào. Nếu có các sản phẩm khuếch đại không mong
muốn, chúng ta sẽ thu đợc băng điện di có nhiều vạch.
10
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368
Xem trên băng điện di:
Cột ở bên trái là hỗn hợp các đoạn đã biết kích thớc để so sánh. Chú ý rằng
khoảng cách giữa các đoạn trên cột là cấp số mũ.
Cột 1: đoạn PCR dài khoảng 1850 bazơ.
Cột 2 và 4: các đoạn dài khoảng 800 bazơ.
Cột 3: không có sản phẩm nào đợc tạo thành, cho thấy PCR đã thất bại.
Cột 5: nhiều vạch đợc tạo ra do một trong những đoạn mồi đã gắn sai chỗ.
Kết quả cuối cùng có thể đợc kiểm tra bằng điện di trên gel polyacrolamide,
các đoạn gen có độ dài khác nhau hiện rõ có thể đọc đợc bằng mắt thờng nhờ
so sánh với thang chuẩn.
11
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368
VII. Các chỉ tiêu ảnh hởng đến phản ứng PCR
Một phản ứng PCR đòi hỏi nhiều thành phần tham gia: 1. AND mẫu làm
khuôn; 2. Enzyme ADN polymerase; 3. Mồi và nhiệt độ lai; 4. Dung dịch đệm
(Nồng độ ion Magiê); 5. Thành phần dNDPs; 6. Thời gian, số lợng chu kỳ phản
ứng; 7. Yếu tố chu trình nhiệt; 8. Nớc; 9. Thiết bị và dụng cụ nhiệt.
1. AND mẫu làm khuôn:
Phản ứng PCR tối u xảy ra trên ADN thật tinh sạch, nhng nhiều kỹ thuật
chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tối u với ADN thu nhận trực tiếp từ dịch chiết
tế bào. Lợng ADN mẫu sử dụng cũng có có khuynh hớng giảm (1 microgam xuống
còn 100 nanogam) với việc sử dụng các polymerase cho hiệu quả cao. Hơn nữa
việc giảm lợng mẫu ban đầu còn có hạn chế đợc các khuếch đại ký sinh (các nhân
bản giả) tạo nên các sản phẩm phụ không mong muốn. Một u điểm khác của phản
ứng PCR là cho phép khuếch đại cả những mẫu ADN không đợc bảo quản tốt, đã
bị phân huỷ từng phần nh trong các vết máu để lâu ngày, tinh dịch đã khô, hoá
thạch tóc, móng tay của ngời đã chết, da, niêm mạc miệng
12
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368
2. Enzyme
Enzyme đợc sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của ADN polymerase I. Vì
đây là enzyme không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp (phải thêm
enzyme mới vào mỗi phản ứng sau mỗi lần biến tính vì enzyme cũ đã bị nhiệt phân
huỷ, nhiệt độ lai thấp khiến sự nhân bản giả tăng cao). Phơng pháp ADN chuyển
sang một bớc ngoặt mới cùng với sự phát hiện một loại ADN polymerase chịu
nhiệt đợc tách chiết từ một vi khuẩn sống trong suói nớc nóng có tên gọi là
Thermus aquaticus. Enzyme này có tên gọi là Taq polymerase không bị phá huỷ ở
nhiệt độ biến tính và xúc tác từ đầu đến cuối quá trình phản ứng.
Điều này cho phép có thể tự động hoá tất cả các bớc của chu trình nhân
ADN nhờ tạo ra một bộ máy tự động có khả năng điều khiển đợc các công đoạn cả
về nhiệt độ và thời gian. Từ đó máy chu trình nhiệt PCR (Thermal Cycler) ra đời và
hiện nay có hàng chục loại do rất nhiều hãng khác nhau trên thế giới sản xuất nh
hãng Perkin Elmer, Eppendorf vv
Taq ADN polymerase không đặc hiệu cho bất kỳ một loại phân tử ADN
riêng biệt nào, chính vì vậy tất cả các phản ứng PCR sử dụng mồi và khuôn khác
nhau đều sử dụng Taq ADN polymerase. Mặt khác một số điểm quan trọng của
Taq- ADN polymerase là có khả năng gắn thêm vào đầu 3 một base là Adenine
(A). Đây là một điểm quan trọng để trong quá trình đồng hóa ngời ta lợi dụng đặc
tính này để gắn sản phẩm của PCR vào plasmide trong quá trình đồng hoá.
Một nhợc điểm của Taq- ADN polymerase là: loại enzyme này chỉ có khả
năng tổng hợp các loại ADN có độ dài dới 3kb (dới 3000 nucleotide), do vậy muốn
nhân bản ADN có độ dài hơn 3-20 kb phải cần những đoạn enzyme khác.
Một nhợc điểm khác của Taq- ADN polymerase là không có khả năng sửa
chữa những sai sót xảy ra trong quá trình sao chép ( trong quá trình sao chép các
base nitơ ở trên mạch đơn đợc tổng hợp, có thể xảy ra sự thay đổi một vài base
nitơ, Taq- ADN polymerase không có khả năng sửa chữa sự nhầm lẫn trong trờng
hợp này).
Ngày nay nhiều polymerase chịu nhiệt khác đã đực đa ra thị trờng với nhiều
chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện hơn. Tth polymerase, một enzyme tách chiết
từ vi khuẩn Thermus thermophilus có khả năng hoạt động nh một enzyme phiên
mã ngợc khi có mặt ARN khuôn và ion Mg
++
; nhng với sự hiện diện của ADN
13
Website: http://www.docs.vn Email : lienhe@docs.vn Tel (: 0918.775.368
khuôn và ion Mg
++
, Tth pol lại xúc tác phản ứng khuếch đại ADN. Enyme này cho
phép khuếch đại bản mẫu là ARN thông qua sự hình thành cADN.
3. Mồi và nhiệt độ lai
3.1. Chiều dài mồi
Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt đợc một sự nhân bản đặc trng và hiệu quả
cao nhằm thu nhận sản phẩm PCR chất lợng cao trên khuôn ADN biết trớc.
Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phơng pháp PCR và tuân thủ một số
nguyên tắc sau:
- Trình tự của mồi đợc chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ xung giữa mồi xuôi
và mồi ngợc, và cũng không có cấu trúc kẹp tóc (hair loop forming) do sự bắt cặp
bổ xung giữa các phần khác nhau trong chuỗi nucleotide của một mồi.
- Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi xuôi và mồi ngợc không cách biệt quá xa
(thông thờng trong khoảng 4-5 độ C). Thành phần nucleotide của các mồi cân bằng
tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần.
- Các mồi phải chọn đặc trng cho trình tự ADN cần nhân bản, không trùng với
các trình tự lặp lại trên gen.
- Độ dài cần chọn cho một mồi đặc hiệu thông thờng là 18-30 nucleotide. Nếu
quá ngắn (dới 10 nucleotide), mồi sẽ bám không đặc hiệu; nếu quá dài (trên 30
nucleotide), chu kỳ nhiệt ở giai đoạn thứ 3 (giai đoạn tỏng hợp hay kéo dài) sẽ ảnh
hởng đến cơ chế bám của mồi. Nhiệt độ nóng chảy của mồi không đợc vợt quá chu
kỳ nhiệt ở giai đoạn thứ 3.
Chiều dài tối u của một đoạn mồi phụ thuộc vào lợng (A+T) của nó. Một
điều cần lu ý về mồi là các đoạn mồi phải đủ phức tạp để khả năng xảy ra việc gắn
mồi vào các trình tự khác mà không phải là trình tự đích đợc chọn trớc rất thấp.
Ví dụ, khả năng bắt gặp A, G, C hay T trong một trình tự ADN cho trớc bất
kỳ là 1/4; khả năng bắt gặp một trình tự dinucleotide bất kỳ (ví dụ AG) là 1/16;
còn khả năng bắt gặp một trình tự 4 bazơ cho trớc là 1/256. Do đó, một trình tự 16
bazơ xét về mặt thống kê sẽ có xác suất có mặt là 1 trên 4
16
(= 4 294 967 296, hay
là khoảng hơn 4 tỉ). 4
16
bazơ tơng đơng với kích thớc hệ gen ngời hay ngô, và lớn
gấp 1000 lần so với kích thớc hệ gen của E.coli. Do đó việc kết hợp một
14
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét